食品中蛋白質(zhì)含量測定方法集錦

2008年毒奶粉事件再次敲響了食品安全的警鐘，不法分子為了提高摻水牛奶中蛋白質(zhì)的含量，添加工業(yè)原料三聚氰胺，由于我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的2種方法“凱氏定氮法”和杜馬斯（Dumas）燃燒法只能測出含氮量，然后根據(jù)氮元素與蛋白質(zhì)換算系數(shù)計(jì)算蛋白質(zhì)的含量，但并不能區(qū)分牛奶硝化后氮的來源，如果添加違規(guī)化學(xué)物質(zhì)，就可以測出較高的“蛋白質(zhì)含量”。三聚氰胺并非惟一的替代添加物，只要含氮量大于牛奶中蛋白質(zhì)的化學(xué)物質(zhì)，且性狀和價(jià)格具備條件，在理論上都存在被不法分子利用的可能性。“定氮”方法的先天不足要求采用其它的檢測方法來應(yīng)對，下面介紹幾種直接測定蛋白質(zhì)的方法。

考馬斯亮蘭法：1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法，是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。在酸性溶液中，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合變?yōu)樘m色，在595nm下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度成正比。此法靈敏度較高1～5μg，時(shí)間15min左右，干擾物質(zhì)：強(qiáng)堿性緩沖溶液；SDS；TritonX-100。標(biāo)準(zhǔn)曲線有輕微的非線性，各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差。

雙縮脲法：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4結(jié)合形成紅紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，蛋白質(zhì)的種類雖不同，但發(fā)色率差別不大，組氨酸以外其它游離的氨基酸、二肽等不顯色，除雙縮脲、一亞氨基雙縮脲、二亞氨基雙縮脲、氨醇、氨基酸酰胺、丙二酰胺等少數(shù)化合物以外，非蛋白質(zhì)均不顯色，可以看做這是蛋白質(zhì)的*反應(yīng)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。此法靈敏度較低1～20 mg，時(shí)間30 min左右，干擾物質(zhì)：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等，常用于需要快速，但并不需要十分的蛋白質(zhì)測定。

Folin－酚試劑法：酚試劑法就是來自酚試劑（磷鉬酸、磷鎢酸的混合液），在堿性條件下，和蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的呈色反應(yīng)與雙縮尿反應(yīng)的復(fù)合方法。磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。此法靈敏度高5μg左右，時(shí)間1 h左右，干擾物質(zhì)：尿素、硫酸納、硝酸納、三氯乙酸、乙醇、乙醚、丙酮等，測定時(shí)要控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。

紫外吸收光譜法：紫外吸收光譜法是直接測定芳香族氨基酸對紫外線吸收光譜（酪氨酸和色氨酸的zui大吸收為280nm）及肽鍵對紫外線吸收光譜（肽鍵的zui大吸收為190 nm）來定量蛋白質(zhì)的一種分析方法。

凱氏定氮儀法：凱氏定氮儀作為測定蛋白質(zhì)的儀器，廣泛應(yīng)用于乳與乳制品中蛋白質(zhì)的含量的測定。凱氏定氮儀采用凱氏定氮法原理，即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)堿滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。全自動凱氏定氮儀（http://www.dsddy.cn/）包括凱氏定氮儀蒸餾裝置和消化爐，而其他的半自動定氮儀則不含有消化爐，需要在購買時(shí)自己配置單獨(dú)的消化爐。